ROZWÓJ NOWEJ TECHNOLOGII WYKONYWANIA SZYBKIEGO BADANIA KRWI
PRZY UŻYCIU NANO-CZĄSTEK I PRZECIWCIAŁ,
STOSOWANEJ W DIAGNOSTYCE EKSPRESOWEJ

dr Piotr Hołownia

(Sala Orłów POSK w Londynie 25.09.03)

(DEVELELOPMENT OF A NEW TECHNOLOGY FOR A FAST CLINICAL BLOOD TEST USING NANOPARTICLES AND ANTIBODIES; APPLICATION TO PATIENT POINT OF CARE TESTING)

Praca wykonana w dziale Biochemii Klinicznej pod kierownictwem Prof. Chris Price w St Bartholomews & Royal London Hospital Medical School w latach 1993-2001.

Sponsorami przez ostatnie cztery lata byli: DTI, (Department of Trade and Industry) i BBSRC, (British Biotechnology Scientific Research Council) jako część projektu 'LINK'.

Zarówno stany chorobowe jak i ich leczenie znajdują swoje odzwierciedlenie w biochemii krążenia krwi. Identifikacja stanów chorobowych oparta jest głównie na klinicznej analizie krwi, (plaźmie/serum). Biochemiczne testy wykorzystywane są do: diagnozy klinicznej, ewidencji chorób, zaburzeń oraz stanowia informacje dotycząca przyczyn, monitorowania (screening), badania przebiegu choroby oraz skutków leczenia. Analizy wykonywane są głównie w centralnych laboratoriach przyszpitalnych, rzadziej w przychodniach. Istnieje potrzeba szybkiego wykonywania analizy w celu wspomagania decyzji podejmowanych przez lekarza w procesie badania pacjenta zarówno w sytaucjach zagrożenia życia jak i w badaniach rutynowych. Stąd wywodzi się określenie 'Near Patient Testing' czy 'Point of care testing'. Wymagania stawiane analizie to: szybkość i łatwość automatyzacji procesu (prostota), wysoka dokładność pomiaru (wrażliwość metody na wielkość próbki - małych objętości) i wyniku, bardzo wysoka specificznosc 'specificity', możliwość miniaturyzacji procesu i stabilność składników i ich jakosci

Wiekszość testów klinicznych oparta jest na analizie przeciwciał nazywanej 'Immunoassay', czyli testami immunologicznymi. System immunologiczny człowieka jest w stanie rozpoznać jedna specificzną molekułe, (antigenna) w objętości ok. 108 (100 millionow) molekuł (>5KD). W obecnych testach koncentracja, czyli stężenie molekuł moze byc mierzona na poziomie pico-gramów/litrze, czyli 10-12 gramów/litr. Istnieja dwa rodzaje 'Immunoassay'. Metody heterogennne: używają odłączania form zajętych przeciwciałami przez znakowany antigen 'bound label' oraz znakowanych form wolnych 'free label' nie złączone z przeciwciałem. Przyklady to 'radioimmumoassay' (RIA), albo 'enzyme linked immunosorbent assay' (ELISA). Procedura tych metod jest czasochlonna i skomplikowanna. Metody homogenne są dużo prostsze. Sygnał pochodzący od znakowanych przeciwciał jest zmieniony kiedy przeciwciało łączy się z antygenem i nie ma potrzeby odłączenia form. Najczęściej stosowane są: EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique), FPIA (fluorescence polarisation immunoassay) i PIA (Particle immunoassays) - czyli testy immunologiczne cząstkowe.

Najczęściej używanymi cząstkami są latex, (średnicę 50-3000nm). Podstawą metody jest imunoaglutynacja która polega na skrzyżowanym łączeniu ('cross linking') między przeciwcialem i antygennami, które może być sprowokowane (direct) albo hamowane (inhibitory). Metoda PIA umożliwa mierzenie antygenów duzej lub malej wielkości (0.3 do >250KD). Stabiliność form łączonych z cząstkami latex zawiera się w 1-2 lat. Metoda ma bardzo prosty sposób mierzenia (detection), jest łatwa do automatyzacji, ma odporność na inne substancje w plaźmie/serum, jest dosyć szybka (około 5-10 min), ale najmniesza ilość, w której można mierzyć antygen wynosi około mikrogram/L, czyli 10-6 gram na litr. Istnieje potrzeba dalszego zmniejszenia objętości próbki. Zasada mierzenie imunoaglutynacja polega na 'turbidmetry' (mętność) - zrost rozproszenia swiatła używając spektrofotometrii. Zeby wzmocmić dzialanie PIA potrzebny jest mocniejszy sygnał i szybsza reakcja. Mozna osiagnąć te zamiary przez zmianę warunków (environment), dotyczących fizyko-chemicznego oddziaływania przeciwciała z antygenem albo zmienić podstawowe materiały. Ważnym w obydwu wypadkach jest utrzymanie równowagi pomiędzy oddziaływaniem i stabilnością kolloidową. Temat tego wykladu dotyczy zmiany materiałów i rozwój nowej technologii.

Odkryto, że zamiast cząstkami latexu można używać nano-cząstki ferrofluidy ('ferrofluids'). Są to cząstki tlenków żelaza ('iron oxide') 'Magnetyt' Fe3O4 i posiadają cechy 'superparamagnetyczne'. Wielkość (średnica) jest około 10nm (1/100,000,000,000 m) trochę większe niż przeciwciala. Około 4 razy mniejsze od latexu, posiada 'refractive index' 3 razy większy i z tych powodów dużo więcej rozprasza swiatła (prawo Rayleigh). Inną ważną cechą jest to, że małe organiczne molekuły (np. citrate) mogą chemicznie łączyć się z powierzchnią ferrofluidow. Stabilność koloidowa jest utrzymana przez negatywny ładunek (negative charge), od warunków pH ('kwasu/zasady') w fiziologicznym stopniu 7.4. Ferrofluidy dają też możliwość większej ilości cząstek w określonej pojemności - więcej przeciwciał - szybsza kinetyka chemiczna - prawo 'mass action'. W prezentacji (25.09.2003) pokazane były przykłady mierzenia CRP (C-reactive protein). Obecność ponad 2mg/L wskazuje na stan zapalny w organiźmie. Przykłady ilustrowały:
a) stabilność kolloidowa cząstek ferrofluidów złączonych z preciwciałami w warunkach różnych pH. W warunkach (ph=7.4) trwało ponad 40 dni, a w ph="5 i" ph="9" trwało tylko parę godzin;
b) porównania przyrostu sygnału rozproszonnego swiatła w ciągu immunoaglutynacji miedzy immunoassay oparte na latexie i ferrofluidach. Trzy razy więcej sygnału pokazuje używanie ferrofluidów;
c) wykres kalibracji (calibration) immunoassay z ferrofluida pokazając wrażliwość mierzenia CRP stężenia mniej niz 0.1mg/L porównane z latexem na poziomie 2mg/L.

Wnioski. Nano-cząstki ferrofluid mogą zastąpić latex w testach imunologicznych. Szybsza analiza (30-60 sec) i wykonywanie na mniejszych stężeniach antygenu jest możliwa. Ferrofluidy posiadają również potencjał do używania w testach opartych na formach heterogennno imunologicznych wykorzstając oddzielenie magnetyczne. Rownież prosta technologia nadaje się do automatyzacji i miniaturyzacji dla 'near patient testing instruments'. Prezentowana praca została opatentowana.